15.3 按功能特点寻找基因：蛙卵表达克隆
表达克隆，是典型的按照基因编码的蛋白质可能具有的功能，而克隆基因。
用于表达基因的细胞可以根据不同需要而定。用非洲爪蟾卵母细胞(以下简称卵母细胞)，是其中一种(Mowry, 2020)。
将其他生物来源的基因，体外转录为mRNA后，注射到爪蟾卵母细胞，可以观察到mRNA被翻译为蛋白质(Gurdon et al., 1971)。
但要能够用于表达克隆，例如某些神经递质或者激素的受体，不仅mRNA能够在卵母细胞表达、而且产物蛋白质能够上细胞膜，如果本身不能被检测到，就还需要其下游偶联的分子也存在，而能够在细胞外给予其激动剂时检测到反应。
(来自Sumikawa et al., 1981)
烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）本身是离子通道，可以上膜，形成可以被检测到的离子通道，用电鱼电器官获得的mRNA注射到卵母细胞，检测到了nAChR的反应（Sumikawa et al., 1981）。
(来自Moriyoshi et al., 1991)
对哺乳类学习记忆至关重要的NMDA受体，就是用卵母细胞的表达克隆所找到的（Moriyoshi et al., 1991）。
（日本天皇、首相，与 分子神经生物学家 中西重忠）
（中西重忠，用卵母细胞克隆编码NMDA受体的基因）
五羟色胺有多种受体，其中5-HT1c受体也是离子通道，是通过卵母细胞的表达克隆而发现的（Lübbert et al., 1987; Julius et al., 1988）。从富含5-HT1c的肿瘤制备cDNA文库，注射mRNA有5-HT引起的氯离子通道形成，然后继续筛选直到一个cDNA。
(来自Masu et al., 1987)
神经肽K物质的受体不是离子通道，而是GPCR，但其下游偶联的信号转导通路有可以被检测的反应，也可以用卵母细胞克隆K物质的受体（Masu et al., 1987）。
(来自Hediger et al., 1987)
电流检测之外，还有其他方法检测功能。例如，转运蛋白可以转运特异的底物，如果有可以同位素标记的底物（Hediger et al., 1987），或者现代化学分析仪器（质谱等）可以检测的底物，那么也可以用来表达克隆编码转运蛋白的基因。
参考文献
Mowry KL (2020). Using the Xenopus oocyte toolbox. Cold Spring Harbour Protocol doi:10:1101/pdb.top095844.
Gurdon JB,Lane CD, Woodland HR, Marbaix G (1971). Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature 233:177-182.
Sumikawa K, Houghton M, Emtage JS, Richards BM and Barnard EA (1981). Active multi-subunit ACh receptor assembled by translation of heterologous mRNA in Xenopus oocytes. Nature 292:862-864.
Moriyoshi K, Masu M, Ishii T, Shigemoto R, Mizuno N and Nakanishi S (1991). Molecular cloning and characterization of the rat NMDA receptor. Nature 354:31-37.
Lübbert H, Hoffman BJ, Snutch TP, van Dyke T, Levine AJ, Hartig PR, Lester HA and Davidson N (1987). cDNA cloning of a serotonin 5-HT1Creceptor by electrophysiological assays of mRNA-injected Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:4332-4336.
Julius D, MacDermott AB, Axel R and Jessell TM (1988). Molecular characterization of a functional cDNA encoding the serotonin 1c receptor. Science 241:558-564.
Masu Y, Nakayama K, Tamaki H, Harada Y, Kuno M and Nakanishi S (1987). cDNA cloning of bovine substance-K receptor through oocyte expression system. Nature 329:836-838.
Hediger MA, Coady MJ, Ikeda TS and Wright EM (1987). Expression cloning and cDNA sequencing of the Na+/glucose co-transporter. Nature 330:379-381.
2024-2
2.2）2012年生理奖的背景
2012年的诺贝尔生理或医学奖，肯定了发育生物学基本问题的研究。
这是发育生物学第四次获诺贝尔奖。第一次是1935年德国的Hans Spemann （1869-1941）（因为他发现胚胎诱导现象）、第二次是1986年意大利女科学家Rita Levi-Montalcini（1909-）（因为她发现神经生长因子）、第三次是1995年德国的女科学家Christiane Nüsslein-Volhard、美国的Eric Wieschaus和Edward Lewis（因为他们研究果蝇发育的基因）。百年来，发育的奖一半给了德国，是因为德国在十九世纪创立了近代发育生物学，并多年领先。
我们每个人都是始于一个细胞（受精卵）。这一个细胞分成两个细胞，再分成四、八、十六、三十二、六十四个细胞，如此直至很多很多细胞，而这些细胞的形态和功能都不一样。也就是说，最初的一个细胞，有多种潜能，而最后分化的细胞，只参与一个功能，比如长出头发的细胞、组成眼睛的细胞，不同于脑中、肝脏和肾脏的主要细胞。
从发育生物学来说，一个多潜能的细胞，如何变成分化的细胞，这个过程发生了什么变化、是否可逆？
从再生医学希望人造器官来说，粗略可以分成两步：第一步把已分化的细胞（如皮肤的细胞）退回多潜能状态的细胞（多能干细胞）；第二步把多能干细胞变成我们需要的细胞（比如肾脏的细胞）？如果可以这样，也许当我们失去眼睛、肾脏、胳膊的时候，我们用自己无关紧要的细胞（如皮肤上刮下一点），重新制造我们失去的细胞、组织、器官，在应用上有着诱人的前景，可惜目前还做不到。
Gurdon和山中伸弥的工作与第一步有关：Gurdon研究是否分化的细胞能退回多能细胞，而山中伸弥研究用什么分子可以将分化的细胞退回多能干细胞。有很多人在做第二步（将多能干细胞变成我们希望的分化细胞），但尚需确定高效的、公认的、无副作用的方法。
Gurdon和山中伸弥的工作在目前来说做得相当好，所以得了诺贝尔奖。但这类工作有其他里程碑，另外并未终结此领域的研究，现在也不是非常清楚山中伸弥的成果最后应用意义有多大。
他们的工作本身有很长的历史背景，可以推到十九世纪德国的近代实验胚胎学创始人Wilhelm Roux （1850-1924）。但简单的是推到1952年，美国费城的科学家Robert Briggs和Thomas King。他们于1952年发表一篇论文，将原来只在单细胞生物阿米巴做过的核移植技术（nuclear transfer），成功地建立于多细胞生物。他们把蛙的细胞核转移到另外一个去除细胞核的细胞里面，让后者发育生长。他们想检验细胞核在发育过程中是否潜能有所改变。当时，他们只检查了胚胎发育比较早的几个时期细胞核，发现越早成功率越高。
1958年，当时在牛津大学的Gurdon等用Briggs和King同样的方法，换了一种蛙，也能做核移植，而且观察到同样现象，越早的细胞核，约能支持胚胎从开始发育到成熟。晚的细胞核成功率降低。但是，Gurdon强调晚的细胞核竟然还有全能性，他们当时最晚是早于蝌蚪的时期。1962年，Gurdon用蝌蚪肠子的细胞核也获得成功，进一步支持分化的细胞，其细胞核仍有全能性，只是需要和早期的细胞质放在一起。这个工作一方面说明晚期细胞核还有全能性，另外一方面说明早期细胞质有保持或诱导全能性的能力。
1996年英国爱丁堡Roslin研究所Wilmut团队把羊胚胎的细胞到体外培养后，取其细胞核移植到早期卵母细胞，可以长成羊（Campbell et al., 1996）。1997年，Wilmut等从成年羊的乳腺中获得细胞，取细胞核移植到卵母细胞，可以获得羊(Wilmut et al., 1997)。1997年克隆羊的实验，证明哺乳类动物分化的细胞，其细胞核可以重新变成具有全能性的胚胎干细胞。
所以，核移植与细胞核全能性的工作，突出的是Briggs和King、Gurdon、Wilmut。不过，Briggs于1983年去世、King于2000年去世。
Gurdon本人为很多人尊敬，有很多人希望他得奖。他是一个非常聪明的人（最近我才听说中学老师认为他生物学很差，不过这不是后来科学家对他的评价，他在1990年代的研究，与我当时的研究是同一领域，我们常感叹他的研究聪明，也曾推荐学生上课要读他1990年代的文章）。在英国有一批科学家，他们做工作很有趣，做科学不是为了吃饭，是为了好玩。美国也许从来没有过绅士科学家，现在英国这样的科学家也不多了，Gurdon是绅士科学家。
日本科学家今年得奖的工作有两个基础，一是核移植显示分化细胞的核未丧失全能性，另一是分子生物学研究细胞命运。研究细胞命运的基因，最重要的工作是德国的Christiane Nüsslein-Volhard、美国的Eric Wieschaus和Edward Lewis，他们发现了很多控制果蝇胚胎发育的基因，于1995年获诺贝尔奖。他们研究的主要方式是让单个基因突变以后，看胚胎的表型，从而推论某个基因对某个发育过程是必需的。1987年美国西雅图Fred Hutchison癌症研究中心Harold Weintraub实验室做了一个很漂亮的实验。他带领研究生Robert Davis和博士后Andrew Lassar，用分子生物学的方法研究一个基因对细胞命运是否起到充分的作用。有一种成纤维细胞（称C3H10T1/2），在一种药物处理下，不知为什么，会变成肌肉细胞。Weintraub实验室比较成纤维细胞和肌肉细胞之间表达哪些不同的基因，找到三个差异表达的基因。他们将每一个基因单独转入成纤维细胞，结果其中一个可以将成纤维细胞变成肌肉细胞，他们称这一基因为MyoD（肌肉决定）（Davis et al., 1987）。其后，他们和多个实验室发现，MyoD可以将好些不同细胞变成肌肉细胞，这是通过单个基因改变细胞命运的里程碑。2012年Lasker获得者Tom Maniatis称Weinbraub是他认识的最聪明的生物学家，可惜Weintraub患脑瘤去世了。
1995瑞士巴塞尔生物中心的Walter Gehring带领实验室发表一篇论文，发现在果蝇中，用一个基因可以诱导眼睛产生，果蝇的这个基因称为eyeless、它在脊椎类动物的类似基因称为Pax6。还在摩尔根时代就知道：没有这个基因，眼睛减小很多。Gehring实验室克隆到这个基因后，发现它平时表达在早期眼睛里，而通过转基因将它表达到身体其他部分，可以在多个部位长出眼睛，如翅膀上、腿上（Halder，Callaerts and Gehring 1995)。这表明，通过单个基因可以改变一些细胞的命运导致一个器官的形成，至少在果蝇如此。
可惜的是，在脊椎动物、哺乳动物，还没有找到用单个、或多个基因制造组织、器官的方法，人造生物器官的梦想还需要努力。
多能干细胞也是一种细胞命运。1990年，日本的Okamoto等、德国的Scholer等分别独立发现多能干细胞特异表达的Oct4基因。2003年，山中伸弥实验室和英国的Chambers等独立发现另一个对维持多能干细胞重要的基因Nanog（Mitsui et al., 2003；Chambers et al., 2003）。Oct4和Nanog可以使少数种类的细胞变成干细胞，但一般来说，它们单独不能将分化的细胞变成干细胞，还需要其他因素。
在这些基础上，有了山中伸弥的工作。
山中伸弥原来的科学背景较弱，在美国进修时实验室也不是很好，回到日本时的研究条件也不很好。但他坚持不懈，一步一步，沿着自己原来的研究经常问问题，最后做了很好的工作。2003年，他实验室作为发现Nanog的两个实验室之一（Mitsui et al., 2003；Chambers et al., 2003），首次为较多科学家注意。进一步，他实验室的Takahashi和他选择了多能干细胞与一般细胞不同的基因，他们估计了24个基因，然后把24个基因同时导入分化的细胞，结果能够将后者转化为多能干细胞，他们逐步做减法，减去某一个，最后发现只需要4个基因（Myc，Oct4，Sox2和Klf4）就足以将分化的细胞变成多能干细胞（Takahashi and Yamanaka，2006）。他们将由此得到的干细胞称为诱导多能干细胞（iPS）。这一工作立即引起广泛的瞩目。
他们2006年的工作是用老鼠细胞做的。2007年，他实验室(Takahashi et al.,2007)、以及美国迪斯康斯大学汤姆森实验室的俞钧瑛等(Yu et al., 2007)，独立报道4个基因也可以使人的细胞转化为多能干细胞，两个实验室用的具体4个基因有2个不同。
iPS立即为很多实验室使用，并认为有很多应用潜能。不过，iPS的应用还有尚未完全解决的问题。最后用于再生医学的途径和方法，迄今未知，所以，如果最后需要制造干细胞，而且制造干细胞的方法是通过用基因诱导干细胞，那么今年奖山中伸弥是对的。不过，也还有可能：最后应用的方法不用制造干细胞，直接从一种分化的细胞变成另外一种分化的细胞，省略干细胞一步，那么方法就完全是Weintraub等1987年发明的；也可能最后制造应用的方法是目前大家想不到、完全不同于山中伸弥的方法和途径。所以，虽然大家对iPS还在兴奋期间，但工作尚未完成、意义未经长期检验。
很多人推崇已经79岁的Gurdon，把他和山中伸弥合在一起，可能也是山中伸弥2006年工作出来时间不久就获奖的原因之一。
2018年3月25日剑桥大学
2.3) 结语
对各种评价/评审共识度是否高，取决于：1）领域是否有共同价值观，2）评审者的专业水平，3）评审者的公正性，以及4）评审者花一定的精力做足功课。文学奖与和平奖难以获得大家共识，主要是第一种原因，讨论起来很快就变成价值和立场的争论。而诺贝尔自然科学奖，虽然一般在科学界有相当大的共识，但也会出现不同意见、出现错误，常是第四种原因。在国内评审中，可能第三种情况多一些。
如果将诺贝尔奖奉为神明，不直接读原始文献，讲课、写教科书按诺贝尔奖的描述，就可能夸大一些工作、忽略一些真正重要的工作，不了解科学事实和研究的历史进程，有时误导学生和其他后来者。
如果误以为发了诺贝尔奖就是定论，就可能因为诺贝尔奖的写法而误以为某项工作已经达到顶峰。实际上，有时不是这样。我们在肯定获奖工作正确部分的同时，无需崇拜、不应该被迷惑，有时意识到还有可能另辟蹊径，走不同的道路、做不同的研究，才更有意义。
文献：
Briggs R and King TJ (1952). Transplantation of Living Nuclei From Blastula Cells into Enucleated Frogs' Eggs. Proc Natl Acad Sci USA38:455–463.
Campbell KHS, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I (1996). Sheep cloned by nuclear transferfrom a cultured cell line. Nature 380:64-66.
Chambers I, Colby D, Robertson M, Nichols J, Lee S, Tweedie S, Smith A (2003). Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 113:643-655.
Davis RL, Weintraub H, Lassar AB (1987) Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell 51:987-1000.
Dixon RAF, Kobilka BK, Strader DJ, Benovic JL, Dohlman HG, Frielle T, Bolanowski MA, Bennett CD, Rands E, Diehl RE, Mumford RA, Slater EE, Sigal IS, Caron MG, Lefkowitz RJ and Strader CD (1986). Cloning of the gene and cDNA for mammalian b-adrenergic receptor and homology with rhodopsin. Nature 321:75-79.
Gurdon JB, Elsdale TR, Fischberg M (1958). Sexually Mature Individuals of Xenopus laevis from the Transplantation of Single Somatic Nuclei. Nature 182:64–65.
Gurdon JB (1962). The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. Journal of Embryology and Experimental Morphology 10:622–640.
Halder G, Callaerts P, and Gehring WJ (1995). Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila. Science 267:1788–1792.
Hargrave PA (1977). The amino-terminal tryptic peptide of bovine rhodopsin; a glycopeptide containing two sites of oligosaccharide attachment. Biochim Biophys Acta 492:83–94.
Hargrave PA, McDowell JH, Sremiatkowski-Juszczak EC, Fong S-L, Kuhn H, Wang JK, Curtis DR, Mohana Rao JK, Argos P, and Feldmann RJ (1982). The carboxy terminal one-third of bovine rhodopsin: its structure and function. Vision Research 22:1429-1438.
Hargrave P. A., McDowell J. H., Curtis D. R., Wang J. K., Juszczak E., Fong S. L., Rao J. K., Argos P. (1983) The structure of bovine rhodopsin. Biophys. Struct. Mech. 9:235-244 .
Kimura Y, Vassylyev DG, Miyazawa A, Kidera A, Matsushima M, Mitsuoka K, Murate K, Hirai T and Fujiyoshi Y (1997). Surface of bacteriorhodopsin revealed by high-resolution electron crystallography. Nature 389:206-211.
Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, Segawa K, Murakami M, Takahashi K, Maruyama M, Maeda M, Yamanaka S (2003). The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell 113:631-642.
Nathans J and Hogness DS (1983) Isolation, sequence analysis, and intron-exon arrangement of the gene encoding bovine rhodopsin. Cell 34:807-814.
Nathans J and Hogness DS (1984) Isolation and nucleotide sequence of the gene encoding human rhodopsin. Proceedings of the National Academy of Sciences USA81:4851-4855.
Nathans J, Thomas D, Hogness DS (1986). Molecular genetics of human color vision: the genes encoding blue, green, and red pigments. Science 232:193-202.
Nathans J, Piantanida TP, Eddy RL, Shows TB and Hogness DS (1986).Molecular genetics of inherited variation in human color vision. Science 232:203-210.
Kimura, Y., Vassylyev, D.G., Miyazawa, A., Kidera, A., Matsushima, M., Mitsuoka, K., Murate, K., Hirai, T. & Fujiyoshi, Y. (1997). Surface of bacteriorhodopsin revealed by high-resolution electron crystallography. Nature 389:206-211.
Okamoto K, Okazawa H, Okuda A, Sakai M, Muramatsu M and Hamada H (1990). A novel octamer binding transcription factor differentially expressed in mouse embryonic cells. Cell 60:461–472.
Ovchinnikov YA, Abdulaev NG, Fergrna MY, Artamonov ID, Zolotarev AS, Mrroshnikov AI, Martynov VI, Kustrna MB, Kudelin AB, and Bogachuk AS (1982). The complete amino acid sequence of visual rhodopsin. Bioorg. Khim. 8, 1011-1014.
Ovchinnikov Iu A., Abdulaev N. G., Feigina M., Artamonov I. D., Bogachuk A. S.(1983) Visual rhodopsin. III. Complete amino acid sequence and topography in a membrane. Bioorg. Khim. 9:1331-1340.
Palczewski K, Kumasaka T., Hori T., Behnke C. A., Motoshima H., Fox B. A., Le Trong I., Teller D. C., Okada T., Stenkamp R. E., Yamamoto M., Miyano M (2000) Crystal structure of rhodopsin: a G protein-coupled receptor. Science 289:739-745.
Rasmussen, S.G.F, Choi, H.J, Rosenbaum, D.M., Kobilka, T.S., Thian, F.S., Edwards, P.C., Burghammer, M., Rratnala, V.R.P, Sanishvili, R. Fischetti, R.F., Schertler, G.F.X, Weis, W.I., Kobilka, B.K (2007). Crystal structure of the human beta 2 adrenergic G protein coupled receptor. Nature 450:383-7.
Rosenbaum, DM, Cherezov V, Hanson MA, Rasmussen SGF, Thian FS, Kolbilka ST, Choi H-J, Yao X-J, Weis WI, Stevens RC Kolbika BK (2007). GPCR engineering yields high-resolution structural insights into β2-adrenergic receptor function. Science 318:1266-1273.
Scholer HR, Dressler GR, Balling R, Rohdewohld H, and Gruss P (1990). Oct-4: a germline-specific transcription factor mapping to the mouse t-complex. EMBO J. 9:2185–2195.
Takahashi K, Yamanaka S (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126:663-676.
Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by Defined Factors. Cell 131:861–872.
Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ and Campbell KHS (1997). Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385:810-813.
Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA (2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318:1917-1920.
（2012年发表于《科学通报》第32期）