15 分子生物学筛选
15.1 按表达时间寻找基因
15.2 按表达空间找基因
15.3按功能特点寻找基因：蛙卵表达克隆
15.4 按功能特点寻找基因：钙信号检测
科学研究可以是聚焦一个科学问题、自然现象；也可以是科学家偏好一种技术，利用技术寻找可以由技术帮助解决的问题。
钱永健（Roger Tsien，1952-2016）以其化学和生物学背景，不断发明技术，用于生物学研究，带动技术发明逐渐成为生命科学的研究生涯。他发明钙离子检测的方法有特别的贡献。他先通过改造钙离子的螯合剂，使之在结合钙离子后发出荧光，从而用荧光强度变化检测活细胞内的钙离子浓度，有fura-2等一系列检测钙离子浓度的钙染料（Tsien, 1980， 1981）。在下村脩（Osamu Shimomura，1928-2018）（Shimomura, Johnson and Saiga, 1962; Morise, Shimomura, Johnson and Winant, 1974）和Douglas Prasher（1951-）（Prasher et al., 1992）工作的基础上，钱永健参与证明单个蛋白质（绿色荧光蛋白， GFP）可以因为结合钙离子后发出荧光（Heim, Prasher and Tsien, 1994；Chalfie et al., 1994）。
已知辣椒里面的分子辣椒素（capsaicin）可以增强痛敏感性、也可以造成热感。David Julius（1955-）于1980年代在Richard Axel实验室做博士后的阶段用表达克隆寻找五羟色胺的受体（Julius et al., 1988）。到旧金山加州大学任教多年后，他继续用表达克隆，其中一个课题为寻找辣椒素的受体，认为找到辣椒素的受体可能有助于理解痛觉的机理。这一研究最后对感觉系统的分子机理有很大影响，且不限于外周感觉系统，虽然对理解痛觉影响相对较小。已知脊髓背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）不仅传入多种外周感觉，而且对辣椒素有反应。英国科学家用同位素标记的离子证明辣椒素（capsaicin）可以诱导大鼠背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）的神经元产生钙离子内流和钠离子内流、不诱导氯离子外流（Wood et al., 1988）。依据这一特征， Julius带领实验室，用DRG的mRNA制备cDNA文库，然后转染到普通培养细胞（常用的HEK293细胞）。起步估计用了含一万六千多种cDNA的库，不断分群并检测，最后拿到一个cDNA，单独转染到HEK细胞就可以对辣椒素出现钙离子内流的反应（Caterina et al., 1997）。编码的蛋白质当时命名为VR1，它不仅介导对辣椒素的反应，而且介导对热的反应，被加温所激活。
有趣的是，VR1并非独一无二的蛋白质，而是属于一个已经知道蛋白质氨基酸序列的家族：Trp通道。但是，在Julius发现VR1介导对辣椒素和热反应时，Trp通道家族的功能其实不很清楚。1969年，美国印地安纳州的Purdue大学生物系韩裔教授Willam Pak（1932-2023）用果蝇的视网膜电图（electroretinogram，ERG）研究果蝇的视觉、并寻找影响果蝇视觉的突变种（Pak et al., 1969）。同年，英国爱丁堡大学的科学家发现一种突变，根据ERG的变化，他们称突变果蝇为“瞬间感受器电位”（Transient Receptor Potential，Trp)，相应突变的基因也就是果蝇的Trp基因（Cosens and Manning, 1969）。1989年，美国加州大学伯克利分校Gerald Rubin（1950-）实验室的博士后Craig Montell（1955-）克隆了果蝇的Trp基因（Montell and Rubin，1989）。他们发现Trp基因编码的蛋白质有多重跨膜区，各由大约19个氨基酸组成的疏水段。因为它的突变影响果蝇视网膜对光反应，所以最容易推测的功能是离子通道。但证明它是离子通道花了相当长的时间。Trp类似的基因后来发现于多种生物，包括人。但不仅果蝇的Trp本身并不感受光，其它的Trp具体起什么作用，如何起作用，也都不清楚。
Julius实验室1997年的发现揭示了其直接功能，由此Trp的研究热火朝天，很多人加入Trp研究的行列，发现更多Trp家族成员，发现更多功能，如Julius实验室2002年用薄荷寻找冷敏感的分子（McKemy et al., 2002），结果发现是Trp家族另一成员，有多个Trp通道，温度变化的方向和范围不同的激活不同的Trp通道。还有科学家发现Trp通道感受压力，等等。
视觉、嗅觉、味觉的第一级感受分子都是GPCR。视觉的第一级是通过生物化学分离纯化最早在19世纪得到视紫红质。嗅觉的第一级也被发现是G蛋白偶联的通路，在发现对嗅觉分子敏感的腺苷酸环化酶（Pace et al., 1985）、嗅觉神经元特异的G蛋白（Jones and Reed，1989）和环核苷酸激活的离子通道（Dhallan et al., 1990）的基础上，美国哥伦比亚大学的Richard Axel（1946-）和他的博士后Linda Buck（1947-）通过多聚酶链反应（PCR）发现了小鼠嗅上皮的数以百计的GPCRs（Buck and Axel，1991），以后证明它们是感受嗅觉的分子。味觉再模仿嗅觉也得到类似发现，但味觉的感受分子只有几个，分别对应不同的味觉（甜、咸、苦、酸、鲜）（Hoon et al., 1999; Chandrashekar et al., 2009）。
确定Trp通道的功能，解决了其他常见感觉（温、部分的压、部分的痛）第一级的分子机理，有较大意义。
最初以为听觉也是用一种Trp通道，后来发现听觉的毛细胞还有其他结构完全不同的压力感受分子，如TMC（Kurima et al., 2002; Vreugde et al., 2002; Jia et al., 2020）。而外周和内脏的压力感受器也有多种，如美国加州的Scripps研究所的Patapoutian实验室发现的Piezo（Coste et al., 2010, 2012）和GPCR（Xu et al., 2018）。看起来简单的压力感受，却用了很多结构不同的分子。
Buck L and Axel R (1991). A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell 65:175-187.
Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD and Julius D (1997). The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 389:816-24.
Chandrashekar JC, Yarmolinsky D, von Buchholtz L, Oka Y, Sly W, Ryba NJP and Zuker CS (2009). The taste of carbonation. Science 326:443-445.
Cosens DJ and Manning A (1969). Abnormal electroretinogram from aDrosophila mutant. Nature 224: 285-287.
Coste B，Mathur J, Schmidt M, Earley TJ, Ranade S, Petrus MJ, Dubin AE and Patapoutin A (2010). Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels. Science 330:55–60.
Coste B, Xiao B, Santos JS, Syeda R, Grandl J, Spencer KS, Kim SE, Schmidt M, Mathur J, Dubin AE, Nontal M and Patapoutian A (2012). Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels. Nature 483:176-181.
Dhallan RS, Yao KW, Schrader KA and Reed RR (1990). Primary structure and functional expression of a cyclic nucleotide-activated channel from olfactory neurons. Nature 347:184-187.
Hoon MA, Adler E, Lindemeier J, Battey JF, Ryba NJP and Zuker CS(1999). Putative mammalian taste receptors a class of taste-specific GPCRs with distinct topographic selectivity. Cell 96:541-551.
Jia Y, Zhao Y, Kusakizako T, Wang Y, Pan C, Zhang Y, Nureki O, Hattori M and Yan Z (2020). TMC1 and TMC2 proteins are pore-forming subunits of mechanosensitive ion channels. Neuron 105:310-321.
Jones DT and Reed RR (1989). Golf: an olfactory neuron specific-G protein involved in odorant signal transduction. Science 244:790-795.
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Kurima K, Peters LM, Yang Y, Riazuddin S, Ahmed ZM, Naz S, Arnaud D, Drury S, Mo J, Makishima T et al. (2002). Dominant and recessive deafness caused by mutations of a novel gene, TMC1, required for cochlear hair-cell function. Nature Genetics 30:277-284.
McKemy DD, Neuhausser WM and Julius D (2002). Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 416:52-8.
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Pak WL, Grossfield J and White NV (1969). Nonphototactic mutants in a study of vision of Drosophila. Nature 222:351-354.
Vreugde S, Erven A, Kros CJ, Marcotti W, Fuchs H, Kurima K, Wilcox ER, Friedman TB, Griffith AJ, Balling R et al. (2002). Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics 30:257-258.
Wood JN, Winter J, James IF, Rang HP, Yeats J and Bevan S (1988). Capsaicin-induced ion fluxes in dorsal root ganglion cells in culture. Journal of Neuroscience 8:3208-3220.
Xu J, Mathur J, Vessières E, Hammack S, Nonomura K, Favre J, Grimaud L, Petrus M, Francisco A, Li J, Lee V, Xiang F-L, Mainquist JK, Cahalan SM, Orth AP, Walker JR, Ma S, Lukacs V, Bordone L, Bandell M, Laffitte B, Xu Y, Chien S, Henrion D and Patapoutian A (2018). GPR68 senses flo and is essential for vascular physiology. Cell 173:762-775.
15.5 按功能特点寻找基因：重组激活基因的发现
第七章我们讲到，体细胞DNA重组是免疫球蛋白多样性的最重要原因。
那么，发现重组酶就应该是理解其机理的关键。
1984年，美国分子生物学家David Baltimore（1938-）当时在MIT实验室的研究生Susanna Lewis设计了实验，用k轻链基因的部分序列重构V-J重组。他们选取了鼠胚Vk和Jk及其附近的DNA序列，装在病毒里面。将这种病毒感染淋巴细胞样的体外培养细胞系PD。他们在序列Vk和Jk之间，装了来自细菌的可以产生对霉酚酸起抵抗性的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（xanthine-guanine phosphoribosyl transferase，gpt）。因为预计重组导致其间DNA序列翻转，所以放到病毒的是反向的gpt序列。一旦发生Vk和Jk之间重组，其间的序列翻转，gpt成为正向而可以表达GPT蛋白质，细胞能够抵抗霉酚酸。Lewis等成功地观察到，她们的分子构造，转染入PD细胞系后，经过霉酚酸后得到的细胞株多数都是因出现了Vk和Jk之间DNA重组、gpt序列翻转（Lewis et al.，1984）。
Baltimore实验室的另一位研究生David Schatz用类似Lewis的方法，再构建了一个含B潮霉素抗性基因（hph）的病毒。用两种病毒，他们检验了多种B细胞前体细胞样的细胞系，多数能够重组Vk和Jk之间DNA、翻转gpt或hph抗性基因序列，导致细胞对霉酚酸或B潮霉素有抵抗性。但如果用同样的病毒感染3T3成纤维细胞系，就不能发生Vk和Jk之间DNA重组（Schatz and Baltimore，1988）。Schatz在实验室周会上讲自己工作进展时，以色列来的博士后Yoav Citri（1953-1995）建议想办法激活3T3细胞中的V（D）J重组活性，这一建议影响了后面的研究（Schatz and Baltimore，2004）。
要在3T3细胞发生Vk和Jk之间DNA重组，当时一般的设计应该是把可重组Vk-Jk的细胞（前B细胞）的mRNA做成cDNA文库。文库的大量不同cDNA转染到3T3细胞，后者含有可以检测Vk和Jk之间DNA重组的gpt或hph。在没有转染来自前B细胞cDNA的情况下，3T3细胞会被霉酚酸或B潮霉素杀死。而如果有前B细胞的cDNA导致Vk和Jk之间DNA重组，使得其间的gpt或hph基因成为可以表达的方向，从而有GPT或HPH合成，这样的3T3细胞就能抵抗霉酚酸或B潮霉素。多数3T3细胞都被转染了与重组酶无关的cDNA，这些3T3细胞会被霉酚酸或B潮霉素杀死，剩下可抵抗霉酚酸或B潮霉素的3T3细胞就很可能是表达了重组酶的cDNA从而导致Vk和Jk之间DNA的重组。
因为一种细胞表达很多mRNA从而可以得到很多不同的cDNA，如果是一种cDNA编码重组酶，那么这种方法一般是可行的。但是，如果是多种cDNA编码的蛋白质才能引起Vk和Jk之间DNA重组，那么同时含有两种或多种起作用的cDNA的几率就会很小。Baltimore当时在Whitehead研究所的同事Robert Weinberg（1942-）用分子生物学研究癌症，Weinberg实验室用基因组DNA制备文库。将这种文库转染到3T3细胞时，每个3T3被转染的不会只是单个cDNA，而是一段基因组DNA，可能含相邻几个基因。
Schatz把B淋巴瘤的基因组DNA转染到3T3，基因组DNA接了一种抗性基因（组氨醇脱氢酶），首先用这种抗性基因针对的药物（组氨醇）选择被B淋巴瘤的基因组DNA转染了的3T3细胞。然后用霉酚酸选择发生了V-J重组的3T3细胞。他们从1500个抵抗组氨醇的3T3细胞克隆得到1个抗霉酚酸的3T3细胞株（Schatz and Baltimore，1988）。他们分析发现这一3T3细胞株确实出现了Vk和Jk之间DNA重组，使得其间的gpt表达，而不是其他原因对霉酚酸出现抵抗。但很多人不信，他们附近的实验室认为他们的结果不可靠、发表的是伪迹（Schatz and Baltimore，2004）。
Schatz与研究生Marjorie Oettinger组成两人合作，每天倒班、想方设法克隆重组激活基因（RAG）。他们用特定的寡核苷酸标记基因组的DNA，从出现重组的细胞中通过用于标记的寡核苷酸取得基因组DNA片段，以此克隆了RAG的催化亚基RAG-1（Schatz, Oettinger and Baltimore，1989）。RAG-1基因编码含一千余氨基酸残基的蛋白质，其同源基因存在于有V（D）J重组的动物如人、鼠、兔、羊、马、鸡、蛙。在人和鼠能够进行V（D）J重组的细胞系，RAG-1也有表达。RAG-1表达的细胞和组织与V（D）J重组活性相关：RAG-1表达于鼠的胸腺、骨髓和胚胎，而不在脾脏和脑表达。
在一派大好的形势下，有个异数：含RAG-1基因的18kb DNA，催化V（D）J重组的活性居然与最初全基因组切的片段效率一样，比预计的低100到1000倍。当时他们的估计是也许因为所用的基因组DNA不够长，缺乏某些未知的转录控制元件和34个氨基酸（Schatz, Oettinger and Baltimore，1989）。但后来发现，得到全长的cDNA后，活性也不高（Oettinger et al.，1990）。他们经过几个月的迷惑不解，不断提各种可能。其中一个比较难以置信的可能性是RAG-1旁边碰巧还有一个基因，与它共同起作用（Schatz and Baltimore，2004）。在细菌中，已知相关功能的基因聚集在附近，而动物细胞的基因早已知道并非如此。
她们发现在原初有重组活性的18kb基因组DNA中，RAG-1基因只占其中6.6kb，另有11kb，余下的基因组DNA中还有一个基因。她们进一步的工作证明这个基因可以提高RAG-1重组效率1000倍，因此她们称这一基因为RAG-2（Oettinger et al.，1990）。以后知道，RAG-1独立进化自转座酶Transib，后来又捕获了RAG-2基因进一步增强其活性，之后RAG-1和RAG-2的序列和功能变化成为专门用于Ig基因重组的酶（Carmona and Schatz，2017）。
Carmona LM and Schatz DG (2017) New insights into the evolutionary origins of the recombination-activating gene proteins and V(D)J recombination. Federation of European Biochemical Societies Journal 284:1590-1605.
Lewis S, Gifford A and Baltimore D (1984) Joining of Vk to Jk gene segments in a retroviral vector introduced into lymphoid cells. Nature 308:425-428.
Oettinger MA, Schatz DG, Gorka C and Baltimore D (1990) RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V(D)J recombination. Science 248:1517-1523.
Schatz DG and Baltimore D (1988) Stable expression of immunoglobulin gene V(D)J recombinase activity by gene transfer into 3T3 fibroblasts. Cell 53:107-115.
Schatz DG, Oettinger MA and Baltimore D (1989) The V(D)J recombination activating gene, RAG1. Cell 59:1035-1048.
Schatz DG and Baltimore D (2004) Uncovering the V(D)J recombinease. Cell S116:S103-S106.
附：2000至2003年讲课ppt
2013年：http://blog.sciencenet.cn/blog-2237-749393.html
